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如何使用離心機分離真核生物細胞器

將動植物組織制成勻漿，在適當?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中(選用離心機的一定轉速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。

懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性；pH7.2的條件下；亞細胞組分不容易重新聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

細胞器標記酶的測定是評價細胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料，能對動、植物的細胞或組織在活體狀態(tài)下進行無毒害的染色。由于染料(堿性染料)的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染部分本身具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆集下來。染色法可以顯示出活細胞內(nèi)的某種天然結構存在的真實性，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學變化以至引起細胞的死亡。

差速離心：使用湘智高速冷凍離心機， 將0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差速離心。