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目前,實驗室常用的離心方法有下面幾種:
(1)差速離心法(又稱分步離心法) 采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分步離心的方法,稱為差速離心。操作時,將含有兩種不同顆粒的混懸液,以常速離心,使大的顆粒下沉,將上清液傾倒于另一離心管中,再加大離心力,離心一定時間,分離小的顆粒,反復(fù)多次分離,達(dá)到分離目的。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優(yōu)點是:操作簡單,離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開,并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子;分離時間短、重復(fù)性高;樣品處理量大。缺點是:分辨率有限、分離效果差,沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開,不能一次得到純顆粒;壁效應(yīng)嚴(yán)重,特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時,在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀;顆粒被擠壓,離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。
圖-1 差速離心法原理示意圖
(2)密度梯度離心法(又稱區(qū)帶離心法) 該法又分為速率區(qū)帶離心法和等密度區(qū)帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡,在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點是:具有很好的分辨率,分離效果好,可一次獲得較純顆粒;適用范圍廣,既能分離沉淀系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度的顆粒;顆粒不會積壓變形,能保持顆?;钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對流而引起混合。缺點是:離心時間較長;需要制備梯度液;操作嚴(yán)格,不宜掌握。
①速率區(qū)帶離心法:是根據(jù)分離的粒子在離心力作用下,在梯度液中沉降速度的不同,離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)形成幾條分開的樣品區(qū)帶,達(dá)到彼此分離的目的。臨床常使用的分離液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個核細(xì)胞分離出來,前一種分離液將血液中單個核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)分為一個層,同時提出。而Percoll分離液將血中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分為二個梯度層,分別提取。后者分離效果優(yōu)于前者,但操作繁瑣。
圖-2 速率區(qū)帶離心示意圖
②等密度區(qū)帶離心法:當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時,在離心力場下,顆粒或向下沉降,或向上浮起,一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上(即等密度點)形成區(qū)帶,稱為等密度區(qū)帶離心法。等密度區(qū)帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒的大小和形狀無關(guān),但后兩者決定著達(dá)到平衡的速率、時間和區(qū)帶的寬度。
圖-3 等密度區(qū)帶離心示意圖
(3)分析性超速離心法①分析型超速離心機(jī)的工作原理:分析型超速離心機(jī)主要由一個橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸連接成一個高速的驅(qū)動裝置,此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn),其容納兩個小室:分析室和配衡室。分析室的容量一般為1ml,呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中,其工作原理與一個普通水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗,實驗室離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì),可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質(zhì)和DNA)或折射率的不同對沉降物進(jìn)行監(jiān)測。在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡,結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個“峰”,由于沉降不斷進(jìn)行,界面向前推進(jìn),故“峰”也在移動,從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。
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